此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物,此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA,可以改造形成具有引导作用的sgRNA(singleguideRNA),足以引导Cas9对DNA的定点切割。
作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白,Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifyingfactor),能够共定位RNA、DNA和蛋白,从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合,并表达适当的sgRNA,可靶定任何dsDNA序列,而sgRNA的末端可连接到目标DNA,不影响Cas9的结合。因此,Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA,这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。