1、选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。
2、涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
3、脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。
革兰氏染色法：
1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G ）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G 菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G 菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
